分子腫瘤病毒學實驗室     

Laboratory of Molecular Tumor Virology   

De-Ching, Chang(張德卿)

研究領域 Research Interests

腫瘤病毒學 (Tumor Virology)

我們實驗室主要研究人類多瘤性病毒。人類多瘤性病毒，包括JC病毒及BK病毒，屬於多瘤性病毒科(Polyomaviridae)，約 43nm不含套膜(envelope)，外殼結構是20面體(icosahedron)對稱結構，結構殼體(capsid)由72個次殼體 (capsomere)組成，在結構蛋白內包裹了一環形(circular)雙股DNA基因組(genome)，約有5,000 base-pair。

人類多瘤性病毒引發多樣的腫瘤曾在動物體內證實。JCV接種於新生倉鼠的腦內後，造成95%的倉鼠產生神經管胚細胞瘤。JCV 是人類病毒中唯一會導致靈長類產生腫瘤的，在成猴(owl monkey)腦內接種JCV，會導致腫瘤產生，如星形膠細胞瘤(astrocytoma)，神經瘤及膠細胞瘤。此外，JCV接種於squirrel monkey也會造成星形膠細胞瘤。BK 病毒也被證實會導致hamster的insulinoma, ependynoma, neuroblastoma, pineocytoma及 osteosarcoma等等多樣腫瘤，人類多瘤性病毒的致癌機轉主要是因該病毒腫瘤基因所製造的腫瘤蛋白(large tumor antigen及small tumor antigen)所致。大腫瘤抗原會與細胞內RB及p53蛋白結合而導致細胞癌化。

在長期免疫低下的病人，JC病毒會溶解性地感染人類腦細胞(oligodendrocyte)，引發進行性多病灶腦白質症(progressive multifocal leukoencephalopathy; PML)，因而導致病人死亡。BK病毒會感染腎臟及尿道細胞而引起腎臟炎、出血性膀胱炎及尿道炎等疾病。目前我們實驗室正致力於研究人類多瘤性病毒的致病機轉，企圖瞭解該病毒如何感染人類腦細胞、如何引發細胞病變及病毒如何在細胞內複製。以下將簡要敘述我們這幾年來對人類多瘤性病毒的研究結果。

人類多瘤性病毒在台灣感染情形及基因型鑑定

就病毒的偵測，我們收集正常健康的人及免疫受抑制的人的尿液，經超高速離心病毒後以聚合脢鏈反應(polymerase chain reaction; PCR)、 Southern blot及DNA定序(sequencing)等方法偵測及鑑定人類多瘤性病毒。結果發現約13% (10/75) 的健康人、26% (20/77) 的孕婦及37.5% (18/48) 的自體免疫疾病患者在尿液中排放人類多瘤性病毒，總合平均有24% (48/200) 的樣本含有JC病毒及3% (6/200) 有BK病毒的存在。DNA定序的結果發現在台灣地區盛行的JC病毒基因型，主要為台灣一號 (Taiwan-1; TW-1) 佔52%及CY原始型佔42%。台灣二號 (4%) 及台灣三號 (2%) 為少數。另外，BK病毒之基因型主要為原始型 (archetype)。這些結果顯示免疫受抑制的人，病毒較易活化並排放在尿液中。此外，為了瞭解人類多瘤性病毒在較偏遠地區感染情形，我們在南投縣信義鄉雙龍村及潭南村採集了134件布農族人的尿液做檢測，結果發現有51% (68/134) 有JC病毒存在，其中91% (62/68) 為CY原始型，9% (6/68) 台灣一號。居住在山村中的原住民大多年齡較大免疫力較差，因而可能與較高的病毒排放率有關。另外，JC病毒基因型以CY為主，可反應出該病毒可能經由較封閉性的居所傳染。這些基因型的差異乃位於病毒基因組的調控區 (regulatory region) 包含基因啟動因子 (promoter) 基因增強因子 (enhancer) 及基因複製原始點 (replication origin) 。有鑑於此，不同基因型病毒的複製能力及致病能力可能有所差異，需要更進一步探討。

基因重組病毒殼體之研發

到目前為止對人類多瘤性病毒的研究相當緩慢，病毒在體外培養不易為主要因素之一。為了更進一步研究人類多瘤性病毒的生理特性及致病機轉，我們將JC病毒主要殼體蛋白VP1的基因轉殖到昆蟲細胞及大腸桿菌中進行表達。結果發現VP1蛋白可以在昆蟲細胞及大腸桿菌中表達並自我組裝 (self-assembly) 成為似病毒殼體 (capsid-like) 顆粒。這些殼體可與人類紅血球結合導致血球凝集 (hemagglutination) 現象。此外，在還原劑(DTT) 及金屬螯合劑 (EDTA) 的存在下，重組病毒殼體可被瓦解成次殼體 (capsomere)。這些外型與生理特性意味著基因重組的VP1蛋白摺疊構型 (folding) 與原始病毒蛋白構型 (native conformation) 非常相近。最近 Goldmann 等人也證實於昆蟲細胞內所組裝的似殼體可引發中和性抗體，更確定其構型趨近於原始性。此外，我們也證實在大腸桿菌中所純化的JC病毒顆粒可用來包裝外生性DNA，並可輸送入人類腎臟細胞內表達。因此，基因重組之病毒蛋白不僅有助於JC病毒之分子研究，而且可應用於疫苗、檢驗試劑及基因治療載體之臨床使用。

病毒殼體表面反應區之鑑定

人類多瘤性病毒的殼體主要由VP1所組成，因此VP1的表面結構與寄主細胞表面的接受體 (receptor)、血球凝集分子及中和性抗體之關係非常密切。最近我們參考SV40 VP1的晶體結構，以電腦模擬程式構築台灣三號JC病毒的主要殼體蛋白VP1立體結構。結構顯示BC、DE及HI loops位於殼體表面，可能為反應部位 (interacting domains)。就免疫反應性而言，我們發現人類多瘤性病毒抗體陽性的血清只能與完整的病毒殼體結合而無法與變性的VP1蛋白結合。這些結果意味著JC病毒表面抗原決定部位可能以合作性epitope存在為主。另外，我們也更進一步證實在殼體表面的BC loop為VP1的主要抗原決定部位。在血球凝集分子的研究，我們發現在人類紅血球表面的sialic acid為主要與JC病毒殼體結合的分子。當sialic acid由neuraminidase 切除後，紅血球就無法與JC病毒結合，進而喪失血球凝集現象。最近Liu等人更進一步證實sialic acid為JC 病毒感染細胞所必須的分子，可謂為該病毒的receptor。

病毒組裝之分子研究

在我們過去的研究中得知在金屬螯合劑 (EDTA) 及還原劑 (DTT) 同時存在下會導致JC病毒殼體瓦解成次殼體。最近我們更進一步證明鈣離子為JC病毒殼體組裝所必須，而且鈣離子的結合氨基酸分別位於GH loop的Asp及C-arm的Asp。次殼體的VP1與鄰近次殼體VP1分子藉由鈣離子相互緊扣相連，組裝成二十面體的殼體結構。另外，我們也證明雙硫鏈確實存在殼體內，VP1分子間，雙硫鏈可穩定殼體並扮演保護鈣離子被螯合。DNA包裝 (encapsidation) 是病毒顆粒成熟的重要課題之一。在我們過去的研究中發現JC病毒VP1在大腸桿菌的自我組裝時會包裝DNA於殼體內。最近我們更進一步探討DNA包裝的機制，結果發現VP1的DNA包裝訊號位於N-端12個氨基酸區域。在in vivo及in vitro實驗證明該DNA包裝訊號切除後，無法包裝DNA於殼體內而形成空殼體形態。以上這些發現對於JC病毒顆粒組裝機轉提供重要訊息。

結語

我們對人類多瘤性病毒的生理特性及致病機轉的瞭解還十分有限。JC病毒感染人類腦細胞是否須要藉特殊的接受體，進入細胞後那些核因子 (nuclear factors) 控制病毒走向潛伏感染或溶解性感染，在溶解性感染過程如何引發細胞病變 (cytopathological effects) 以及病毒子代顆粒形成的組裝機轉都是我們實驗室努力研究的方向。大多數人受該病毒感染後並沒有明顯臨床症狀。在免疫力低下時，將導致該病毒再活化而破壞腦細胞引起PML或破壞腎臟細胞引起間質性腎臟炎。免疫系統那些因子抑制人類多瘤性病毒的活化以及病毒的基因如何被調控而走向溶解性感染及癌化感染都是未來研究的重要課題。另外，我們已證實JC病毒殼體可以攜帶外生性基因進入人類腎臟細胞表達。因此，未來我們也將企圖利用該病毒殼體做為基因治療載體進行研究。

實驗室成員 Members

博士生: 周志傑、林育昰

[已畢業學生]

博士: 陳立賢(2009)、方瓊瑤(2009)、張綺芳(2010)、陳碧蓮(2011)、沈正煌(2011)、趙崇男(2016)、林勉君(2019)

碩士: 張綺芳(2001)、蘇倍儀(2002)、徐銘佛(2002)、李美鳳(2003)、黃凱昱(2004)、

劉素勤(2004)、陳香吟(2004)、陳三元(2005)、蘇柔蓁(2005)、鄧如琇(2006)、張芳珮(2006)、吳牧聲(2010)、邱聖子(2010)、林肇柏(2010)、林勉君(2010)、蔡易達(2011)、趙崇男(2011)、黃育甫(2013)、周明杰(2014)、郭子睿(2015)